Agarose-Gelelektrophorese
Agarose-Gelelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode, um Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Stränge nach ihrer Größe zu trennen und um ihre Größe durch Vergleich mit Strängen bekannter Größe zu bestimmen. Diese Gelelektrophorese funktioniert wie ein Sieb für Moleküle; ein elektrisches Feld wird verwendet, um die negativ geladenen DNA-Moleküle durch die Gelmatrix zu ziehen, wobei die kleineren DNA-Moleküle sich schneller durch das Gel bewegen können und somit eine Auftrennung der Stränge nach ihrer Größe ermöglicht wird.
Material
Für die Agarose-Gelelektrophorese werden benötigt:
- Die DNA, die nach ihrer Größe aufzutrennen ist.
- Eine DNA-Leiter, eine Mischung verschiedener DNA-Stränge bekannter Länge, mit der die DNA-Probe verglichen werden kann, um deren Größe zu bestimmen. DNA-Leitern sind kommerziell erhältlich.
- TBE-Puffer, 0.5×, pH 8.0
- EDTA, 0.5M, pH 8.0
- Agarose
- Ethidiumbromid (5.25 mg/ml in H2O)
- Ein Farbmarker, z.B. ein niedermolekularer Farbstoff wie Bromphenol Blau, um den Fortschritt der Elektrophorese abschätzen zu können.
- Eine Gelkammer aus Plexiglas.
- Ein "Kamm" (normalerweise aus Plexiglas oder Teflon).
Vorbereitung
- Herstellung einer 1% Agaroselösung in TBE; für kleine DNA-Fragmente bis zu 2%. Volumen 15-70 ml, je nach Größe des Gels.
- Agarosegellösung kochen, normalerweise im Mikrowellenherd.
- Die Lösung bei Raumtemperatur bis auf ca. 60 °C abkühlen lassen, dabei stetig rühren.
- 1 ml Ethidiumbromid pro 10 ml Gellösung dazugeben. Vorsicht: Ethidiumbromid ist mutagen!
- Die Lösung rühren, bis sich das Ethidiumbromid gut verteilt hat, dann in die Gelkammer gießen.
- Den Kamm auf einer Seite des Gels hineinstecken, ca. 5-10 mm vom Rand entfernt.
- Wenn das Gel fest geworden ist, den Kamm entfernen. Die Aussparungen, die im Gel zurückbleiben, werden Taschen oder Slots genannt.
- Das Gel in 0,5× TBE-Laufpuffer legen. Das Gel muss vollständig bedeckt sein. Die Slots müssen an der negativen Elektrode der Kammer zu liegen kommen.
- Den Farbmarker zu den DNA-Proben hinzugeben. Die DNA-Leiter enthält nun für gewöhnlich schon Farbmarker.
Prozedur
DNA-Leiter und -Proben mit einer Pipette in jeweils einen Slot spritzen (je nach Größe der Taschen von 2 µl bis zu 100 µl). Elektrische Spannung anlegen, normalerweise 100 Volt bei xx mAmpere. Wenn die "Farbfront" das Gel verlässt oder die Stränge genügend aufgetrennt sind, Elektrophorese beenden.
framed|none|Schematische Darstellung der Elektrophorese
- Das Agarosegel mit 3 Slots (S).
- Einspritzen von DNA-Leiter in den ersten Slot.
- DNA-Leiter ist aufgetragen. Proben 2 und 3 werden aufgetragen.
- Eine Spannung wird angelegt. Die DNA wandert zur positiv gelagenen Anode, weil sie negativ geladen ist (Phosphatreste im "Rückgrat" der DNA).
- Kleine DNA-Fragmente wandern schnell, große langsam durch das Gel. Die DNA ist währenddessen normalerweise nicht sichtbar. Daher wird der Fortschritt an der Farbfront abgelesen, die sich schneller als selbst kleinste DNA-Fragmente durch das Gel bewegt.
- Die Farbfront hat das Ende des Gels erreicht, die Elektrophorese ist komplett.
Das Gel kann unter einer UV-Lampe betrachtet werden. Ethidiumbromid, das sich in die DNA eingelagert hat, fluoresziert im ultravioletten Licht (Gesichtsschutz tragen!). Eine DNA-Bande kann aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA zur weiteren Verwendung aus dem Gel aufgereinigt werden.
Darstellung eines Gelbilds
- Siehe auch: SDS-PAGE