Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), kurz auch EIA genannt, ist ein immunologisches Nachweisverfahren, welches im Gegensatz zum Radioimmunoassay (RIA) nicht auf einer Radioaktivitätsmessung, sondern auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert.
Mit Hilfe des ELISA können verschiedenste biomolekulare Substanzen (z.B. Proteine, Viren) oder auch niedermolekulare Verbindungen (z.B Hormone, Toxine, Pestizide) in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin, etc.) nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezieller spezifischer Antikörper zu Nutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Die Antikörper oder teilweise auch das Antigen werden zuvor mit einem bestimmten Enzym markiert.
Für den Nachweis werden Probe und Antikörper eine bestimmte Zeit lang gemeinsam inkubiert. Durch unterschiedliche Wasch- und Trennungsschritte wird dann das gebundene Material (Antigen-Antikörper-Komplex) von dem ungebundenen Restmaterial der Probe getrennt. Mit Hilfe der an den Antikörper gekoppelten Enzyme wird anschließend eine Farbreaktion ausgelöst. Die Stärke der Farbreaktion ist mittels eines Photometers messbar und ihre Stärke proportional zur Konzentration in der Probe. Bei höheren Konzentrationen in der Probe, oder bei längeren Zeiten der Farbreaktion entsteht eine sigmoidale Kurve, weil das Substrat der Farbreaktion zum grössten Teil umgesetzt wird.
Häufig wird jedoch auch der kompetitive Immunoassay angewendet. Hierbei wird kein markierter Antikörper verwendet, sondern ein markierter Kompetitor (eine synthetische Verbindung, die dem Analyten strukturell ähnlich ist und auch am Antikörper bindet) eingesetzt. So kommt es zur Kompetition zwischen Analyt und Kompetitor um einen Bindungsplatz am Antikörper. Das Signal ist hier nicht proportional zur Analyt-Konzentration, sondern läßt sich mit einer sigmoidalen Kurve beschreiben.
thumb|Logit-Funktion
Auswertung des ELISAs mit Hilfe des Logit-Log-Plot
Eine sigmoide Kurvenform tritt dann auf, wenn man auf der x-Achse den natürlichen Logarithmus der Konzentration aufträgt, und auf der y-Achse die Extinktion (=OD=optische Dichte=Absorption). Diese Darstellungsform ist das halb-logarithmische Diagramm.
Um eine lineare Regression berechnen zu können, muss man diese Sigmoide vorher linearisieren. Zu diesem Zweck behält man die Dimension der x-Achse bei, und rechnet die y-Achse in Logit-Werte um. Dabei sollte eine gerade Linie entstehen. Diese Darstellungsform wird Log-Logit-Plot, Logit-Log-Plot oder auch Logit-Plot genannt.
Um Logit-Werte aus den Extinktions-Werten berechnen zu können, muss man zuerst die Extinktions-Werte (w) normalisieren (n), so dass sie einen Bereich von 0 bis 1 abdecken. Dazu benötigt man die untere (u) und die obere (o) Asymptote der sigmoiden Kurve.
Umkehrfunktion:
Diese normalisierten Extinktions-Werte (n) gehen dann in die Logit-Gleichung ein (L):
Umkehrfunktion:
Die Werte-Paare des Logit-Log-Plots aus dem x-Wert = natürlicher Logarithmus der Konzentration, und dem y-Wert = Logit der normalisierten Extinktions-Werte (L) gehen dann in die Berechnung der linearen Regression ein. Diese liefert dann die Höhe (a) und die Steigung (b) der Geraden-Gleichung:
Umkehrfunktion:
Für die Interpolation von unbekannten Mess-Werten auf die so erstellte Eich-Kurve benötigt man dann die Umkehrfunktionen. Die höchste Genauigkeit wird in der Nähe des in der Mitte der Sigmoiden liegenden Wendepunktes erreicht, weil an dieser Stelle ihre Steigung am grössten ist. Die geringste Genauigkeit entsteht in der Nähe ihrer Asymptoten.
Falls man aus mehreren unterschiedlichen Mess-Werten mit Hilfe der Asymptoten der Eich-Kurve eine Mess-Kurve errechnen kann, dann ist es am genauesten, wenn man die Wendepunkts-Konzentration der Eich-Kurve mit der Wendepunkts-Verdünnung der Mess-Kurve vergleicht. Die Asymptoten der Mess-Kurven werden ignoriert, weil man alle Mess-Ergebnisse auf den Wendepunkt der Eich-Kurve beziehen muss, der bei den y-Werten n = 0,5 im halb-logarithmischen Diagramm, identisch mit L = 0 im Logit-Log-Plot, zu finden ist. Bei der halb-logarithmischen Darstellung der Mess-Kurve dient der natürliche Logarithmus des Kehrwertes der Verdünnung als x-Achse, weil bei den Mess-Werten die Konzentration vor der Berechnung noch unbekannt ist.
Grundsätzlich ist es auch möglich, an Stelle der natürlichen Logarithmen ln die dekadischen Logarithmen, oder jene mit der Basis von 2 zu verwenden, oder/und anstelle des Kehrwertes der Verdünnung nur die Verdünnung (Dilution) einzusetzen, oder/und den Wert von n als von 0 bis 100 Prozent gehend zu berechnen, sofern man die Gleichungen korrekt modifiziert. Nicht richtig wäre es aber, den Logit direkt aus den nicht normalisierten Extinktions-Werten w zu berechnen.
Siehe auch: ELISPOT